Tumori tiroidei: occhio al DNA

Lara Bettinzoli, N. 12 dicembre 2005

Da un importante studio realizzato da un’equipe di ricercatori dell’Istituto di neurobiologia e medicina molecolare del Consiglio nazionale delle ricerche, emerge un nuovo ruolo del gene retinoblastoma nell’attività di regolazione delle cellule della tiroide. Questa scoperta rappresenta un passo avanti nella ricerca della cura dei tumori tiroidei. Ne parliamo con il dottor Donato Civitareale, ricercatore dell’Inmm-Cnr e responsabile del progetto.
Da quando, nel 1953, James Watson e Francis Crick scoprirono la struttura del DNA, è iniziato il lungo viaggio dell’uomo alla ricerca della sua identità biologica e molte nuove scoperte si sono succedute in questi anni.
Tra le ultime, la recente scoperta di un altro tassello dello sviluppo dei tumori tiroidei.
Uno studio dell’Istituto di neurobiologia e medicina molecolare del Consiglio nazionale delle ricerche, attribuisce un nuovo ruolo alla proteina retinoblastoma nei meccanismi molecolari che portano alla trasformazione neoplastica delle cellule tiroidee.
Il dottor Donato Civitareale, ricercatore dell’Inmm-Cnr, ci spiega come sono giunti a questa importante scoperta.
Dottor Civitareale, Lei come ricercatore dell’Inmm-Cnr, ha diretto questo studio. Può spiegarci come siete giunti all’individuazione di una nuova funzione della proteina pRb (retinoblastoma), nel controllo del differenziamento tiroideo?
"Siamo partiti da dati presenti nella letteratura scientifica, che attribuiscono a pRb un ruolo cruciale nel differenziamento cellulare come, per esempio, nel differenziamento delle cellule muscolari, delle ossa e anche nel differenziamento dei tireociti, ossia le cellule follicolari della tiroide. Il nostro interesse per queste tematiche deriva dal fatto che il nostro gruppo studia i meccanismi molecolari che regolano l’espressione dei geni tessuto-specifici di queste cellule: di quei geni che codificano per le proteine espresse soltanto nei tireociti, vale a dire per i marcatori del loro differenziamento. Quindi il nostro intento era di identificare, a livello molecolare, il ruolo di pRb nel mantenimento del differenziamento tiroideo".
Cos’è pRb e qual è la sua funzione?
"Il gene Rb ricopre un ruolo importante in moltissimi tipi di tumore. Le sue mutazioni sono state scoperte inizialmente in una rara forma di cancro pediatrico, chiamato appunto retinoblastoma. Da allora, gli scienziati hanno scoperto che, in tutti i casi di neuroblastoma, il tumore si sviluppa quando il prodotto di questo gene è inattivo. Quindi Rb è un anti-oncogene e codifica per una proteina (pRb) a localizzazione prevalentemente nucleare, che controlla il ciclo cellulare e l’apoptosi, ossia il processo che porta al suicidio cellulare. La proteina pRb è particolarmente importante in quello che viene definito il differenziamento terminale, quando cioè vengono espressi, per la prima volta, i geni marcatori del differenziamento e si esce dal ciclo cellulare. Molto si sa su come questa proteina regola l’inibizione del ciclo cellulare, ma meno sul suo ruolo nel differenziamento".
Qual è la funzione della proteina Pax 8 e come si collega con pRb?
"Pax 8 è un fattore di trascrizione (vedi box sui fattori di trascrizione) che si trova in pochissimi tipi cellulari, tra cui le cellule follicolari della tiroide e la sua attività è essenziale sia per un corretto sviluppo della ghiandola tiroidea, sia per il corretto funzionamento del tireocita maturo. Topi che non hanno il gene codificante per Pax 8, sviluppano una tiroide molto piccola e priva delle cellule follicolari, per cui non sono in grado di sintetizzare gli ormoni tiroidei e soffrono di un severo ipotiroidismo. Questi topi nascono, ma muoiono allo svezzamento. Un’altra indicazione del ruolo importante di Pax 8 deriva dal fatto che sono stati trovati pazienti affetti da ipotiroidismo congenito, dovuto ad agenesia tiroidea (mancato o anomalo sviluppo della ghiandola), che avevano mutazioni nel gene di Pax 8. Questa proteina è in grado di attivare la trascrizione di molti geni marcatori del differenziamento tiroideo come la tireoglobulina, la tireoperossidasi e la pompa dello iodio. Quindi, per tornare al nostro lavoro, noi avevamo l’informazione che pRb era importante nel differenziamento tiroideo di cui Pax 8 è un elemento fondamentale. La nostra ipotesi di lavoro è stata, dunque, quella di supporre una sinergia tra queste due proteine. Abbiamo così potuto dimostrare che Pax 8 e pRb interagiscono direttamente e che l’attività di Pax 8 richiede l’interazione con pRb. Quest’ultima, che per altre vie regola l’uscita dal ciclo cellulare, è in grado di mantenere il differenziamento tiroideo interagendo e cooperando con Pax 8. Questo risultato, ottenuto sul differenziamento tiroideo, è simile a quanto è stato descritto circa il differenziamento degli osteoclasti, anche in queste cellule, pRb è richiesto per mantenere il differenziamento ed anche negli osteoclasti pRb interagisce e coopera con un fattore di trascrizione specifico di queste cellule, chiamato CBFA1. Sia in tiroide che negli osteoclasti, pRb ha quindi un ruolo di co-attivatore trascrizionale ed è tramite questa “nuova attività” che riesce a regolare il differenziamento terminale".
Quali sono le differenze principali tra una cellula sana e una tumorale?
"Essenzialmente una cellula tumorale è una cellula che ha perso la capacità di essere regolata. È proprio la mancanza o una modificazione dei meccanismi biochimici della regolazione del ciclo cellulare, del differenziamento e dell’apoptosi, che caratterizzano una cellula tumorale. La cellula trasformata si divide, infatti, continuamente sfuggendo ai meccanismi che regolano l’apoptosi. Diventa, inoltre, autonoma, in altre parole la sua crescita è completamente svincolata dai meccanismi di regolazione che operano nella cellula normale. Per di più, molto spesso le cellule tumorali de-differenziano, perdono cioè l’identità, la funzione specifica che avevano acquisito con il differenziamento. C’è anche una correlazione tra l’aggressività di un tumore e il grado di perdita del differenziamento. Per esempio, i carcinomi tiroidei possono essere suddivisi in differenziati, poco differenziati e anaplastici, cioè completamente de-differenziati. Sono proprio questi ultimi a essere i più aggressivi e ad avere un esito fatale. Un risultato molto interessante che abbiamo ottenuto nel nostro studio, sul ruolo di pRb nel differenziamento tiroideo, riguarda proprio come un oncogene sia in grado di portare alla perdita del differenziamento. L’oncogene di origine virale E1A è in grado di de-differenziare le cellule follicolari della tiroide proprio perché è in grado di legare pRb. E1A riesce a sottrarre pRb dall’interazione con Pax 8, rendendo il fattore di trascrizione incapace di attivare l’espressione dei geni marcatori del differenziamento tiroideo. Nel nostro lavoro abbiamo mostrato che E1A è in grado di inibire l’attività di Pax 8 mentre un E1A mutato nella capacità di interagire con pRb, non inibisce il fattore di trascrizione tiroideo".
Progetti futuri?
"Continuiamo su questa linea di ricerca. I nostri risultati sono stati ottenuti sia in vitro sia utilizzando linee cellulari, per questo vogliamo trasferirli in vivo in un sistema animale. Per esempio è possibile selezionare una linea murina in cui possiamo “togliere” il gene di Rb in maniera inducibile e tessuto-specifica, cioè solo nei tireociti. Questo diventerebbe un eccellente sistema sperimentale per verificare nell’animale il ruolo di pRb in tiroide. Un’altra linea di ricerca che strettamente si collega con i nostri risultati ci viene sempre dalla letteratura scientifica. È stato pubblicato che una proteina chiamata Pax 5, presente solo nelle cellule del sangue, ma estremamente simile a Pax 8 interagisce con una proteina chiamata ID2. ID sta per Inibitore del Differenziamento e ID2 interagisce anche con pRb. L’ipotesi, quindi, è che esista un complesso Pax 8-ID2, che dovrebbe essere funzionalmente inattivo e che, in presenza di pRb, venga distrutto per permettere a Pax 8 di attivare i geni marcatori del differenziamento tiroideo. Questo spiegherebbe come pRb, attivi Pax 8".

Oncogeni ed anti-oncogeni
I proto-oncogeni - spiega il dottor Civitareale - sono generalmente quei geni che codificano per proteine, che regolano il ciclo vitale della cellula, favorendone una crescita normale e controllata. Una mutazione dei proto-oncogeni li trasforma in oncogeni, cioè in proteine che acquisiscono una nuova funzione in grado di promuovere un’incontrollata moltiplicazione cellulare. Gli oncogeni possono essere attivati da agenti cancerogeni come radiazioni, sostanze chimiche, virus e altri ancora. Molti proto-oncogeni codificano per recettori, fattori di crescita, proteine coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare o nella traduzione del segnale e anche per fattori di trascrizione. I geni oncosoppressori o anti-oncogeni, viceversa, favoriscono l’insorgenza del cancro quando sono inattivati. La mancanza di anti-oncogeni depriva la cellula dei necessari meccanismi di regolazione soprattutto del ciclo cellulare, favorendo così la trasformazione neoplastica della cellula. In condizioni di normalità, gli oncosoppressori ci proteggono dai tumori, prevenendo o annullando l’azione degli oncogeni e la crescita incontrollata delle cellule. La mancanza di un gene oncosoppressore o il suo cattivo funzionamento può portare allo sviluppo di un cancro. Oltre a pRb, di cui si parla nell’articolo, un altro anti-oncogene molto studiato è p53. Questa proteina previene, nelle cellule normali, la replicazione del DNA danneggiato e promuove la morte cellulare nelle cellule con DNA alterato.

Il differenziamento cellulare
Durante lo sviluppo embrionale - spiega il dottor Civitareale - le cellule sono inizialmente totipotenti (in grado di poter differenziare in tutti i tipi cellulari) e ricevono tante istruzioni e stabiliscono molteplici interazioni, attraverso le quali restringono, nel procedere dello sviluppo le loro capacità di differenziare fino a diventare cellule in grado di poter attuare un solo programma differenziativo. Una cellula embrionale da totipotente diventa prima pluripotente, restringendo le sue potenzialità di differenziamento, poi “commited” verso un determinato tipo cellulare. In questo stadio non è ancora una cellula terminalmente differenziata, ma ha bisogno di un ultimo evento regolativo, chiamato differenziamento terminale, che le permetta di esprimere i marcatori del differenziamento tipici del tessuto e così iniziare ad assolvere la sua funzione specifica. Parallelamente e in maniera coordinata a questo tipo di maturazione, la cellula perde la capacità di dividersi tanto che una cellula terminalmente differenziata viene definita post-mitotica, cioè incapace di iniziare una nuova duplicazione cellulare, una nuova mitosi. I geni che si esprimono in una cellula terminalmente differenziata si possono dividere in due classi, i geni ubiquitari ed i geni tessuto-specifici. I primi sono i geni espressi in tutte le cellule e richiesti per le funzioni comuni, mentre i secondi sono i geni coinvolti nelle funzioni specifiche di quel determinato tipo cellulare. Per esempio alcune cellule della pelle esprimono le proteine necessarie per la sintesi della melanina come la tirosinasi e non l’emoglobina che invece è specifica delle cellule del sangue. Sia nei melanociti della pelle, che negli eritrociti, i geni della tirosinasi e dell’emoglobina sono, però, ambedue presenti. Quindi, in ogni tipo di differenziamento, deve avvenire una differenziale regolazione, ossia l’attivazione di taluni geni, la loro super-espressione, la repressione totale di altri geni o la loro sotto-regolazione. L’esperimento che più di tutti chiarisce cosa vuol dire differenziamento cellulare è quello fatto da Gurdon più di trenta anni fa. Lo scienziato inglese prese una cellula dell’intestino di una rana, quindi una cellula differenziata che esprimeva le proteine specifiche per la sua funzione e da questa cellula isolò il nucleo che venne successivamente impiantato in un ovocita di rana, in cui, mediante irradiazione con raggi ultravioletti, aveva inattivato il nucleo. Il “nuovo” ovocita, così fertilizzato in vitro e reintrodotto in una rana, era in grado di sviluppare correttamente e di generare un nuovo animale. Quest’esperimento dimostra che il nucleo della cellula intestinale differenziata, conteneva tutta l’informazione genetica cioè un genoma completo, anche se esprimeva solo una parte di esso, quello necessario per la cellula intestinale. Quindi, a partire dalla cellula uovo fecondata, lo zigote, per successive duplicazioni cellulari conservative (in cui il genoma viene trasmesso interamente alle cellule figlie) si arriva alla formazione di un individuo formato da molti tessuti e cellule diverse. In un uomo, ad esempio, vi sono più di trecento tipi cellulari. Comunque, anche se molto abbiamo imparato, la maggior parte degli eventi che regolano lo sviluppo embrionale ed il differenziamento cellulare, rimangono ancora da scoprire.

La tiroide
La tiroide è una ghiandola endocrina presente in quasi tutti i vertebrati. La sua funzione - aggiunge il dottor Civitareale - è di produrre gli ormoni tiroidei mediante le cellule follicolari e la calcitonina mediante le cellule C. Gli ormoni tiroidei sono la tiroxina e la tri-iodo-tironina (T4 e T3) e sono anche detti iodotironine. Le principali funzioni di questi ormoni riguardano la regolazione dei processi ossidativi del metabolismo e del corretto sviluppo scheletrico e psichico. Il differenziamento di un cellula follicolare della tiroide o tireocita è finalizzato alla produzione degli ormoni tiroidei che derivano dalla degradazione di una proteina precursore, la tireoglobulina. A questa proteina vengono legati degli ioni di iodio, iodinazione, da parte di un enzima: la tireoperossidasi. Il tireocita deve essere quindi in grado di concentrare, al suo interno, lo iodio; questa funzione è svolta da un proteina di membrana, la pompa dello iodio. La tireoglobulina iodinata viene secreta nel lumen del follicolo tiroideo ed in risposta a determinati stimoli viene riassorbita all’interno della cellula e degradata. Dalla degradazione della tireoglobulina iodinata derivano gli ormoni tiroidei che, da un punto vista chimico, sono due amminoacidi contenenti una concentrazione elevata di iodio e vengono secreti nel flusso sanguigno. Il riassorbimento della tireoglobulina iodinata e la secrezione degli ormoni tiroidei, sono regolati principalmente dall’attività del recettore della tireotropina (TSH), che si trova sulla membrana plasmatica del tireocita. La tireoglobulina, la tireoperossidasi, la pompa dello iodio e il recettore del TSH, sono i marcatori del differenziamento tiroideo. Ad eccezione del recettore del TSH che viene espresso in pochissimi altri tipi cellulari, le altre proteine sono espresse soltanto nei tireociti. Dallo studio dei meccanismi di regolazione, della loro espressione tiroide-specifica, è stato identificato un gruppo di fattori di trascrizione, i quali hanno un ruolo essenziale non solo per il mantenimento dello stato differenziato e dell’omeostasi del tireocita, ma anche per il corretto sviluppo embrionale di tutta la ghiandola tiroidea. Questi fattori di trascrizione sono TTF-1, TTF-2 e Pax 8. Ognuno di loro si esprime in un numero ristretto di tipi cellulari, ma quello che è specifico dei tireociti è la loro contemporanea presenza, in altre parole le cellule follicolari della tiroide sono le uniche che esprimono contemporaneamente queste tre proteine. Si ritiene quindi che sia proprio la combinazione delle loro attività che specifichi per il differenziamento del tireocita.

Fattori di trascrizione
Un fattore di trascrizione è una proteina che interagisce direttamente con una specifica sequenza di DNA, all’interno del promotore genico. Il promotore si trova a monte di un gene e funziona come un interruttore che permette al gene di essere trascritto e quindi espresso. Ogni gene ha un suo promotore specifico e affinché possa essere trascritto è necessario che sul promotore interagisca una serie di fattori di trascrizione che a loro volta reclutano, sul DNA, altre proteine regolative in maniera tale che tutto il complesso, assemblato sul promotore, sia riconosciuto dall’enzima RNA polimerasi. La polimerasi, così reclutata sul DNA, potrà sintetizzare l’RNA messaggero copiando la sequenza nucleotidica del gene. L’RNA messaggero verrà quindi traslocato sui ribosomi dove codificherà per la proteina. Benché esitano molti livelli di controllo dell’espressione genica, il controllo della trascrizione di un gene è il momento di regolazione generalmente più importante. Poiché trascrivere in maniera controllata un gene è un evento molto dispendioso, la cellula lo trascrive solo quando la proteina codificata è assolutamente richiesta.

Approfondimenti
The Endocrine Society
http://www.endo-society.org/

Thyroid Federation International
http://www.thyroid-fed.org/intro/patients.html

The Thyroid Society For Education And Research
http://www.the-thyroid-society.org/

American Thyroid Association
http://www.thyroid.org/

Thyroid Foundation Of America
http://www.clark.net/pub/tfa/

Latin American Thyroid Society
http://www.lats.org/index.htm

Thyroid Foundation Of Canada
http://home.ican.net/~thyroid/Canada.html

European Thyroid Association
http://www.uwcm.ac.uk/uwcm/md/ETA.html

American Association of Clinical Endocrinologists
http://www.aace.com/

Indirizzi utili
Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare del Consiglio Nazionale delle Ricerche
Piazzale Aldo Moro 7 - 00185, Roma
Tel.: 06.49931 Fax: 06.4461954
Sito: www.cnr.it

Per informazioni Ufficio Stampa Cnr: Anna Capasso; tel. 06.4993.2959
E-mail: anna.capasso@cnr.it

Dottor Donato Civitareale
CNR - Istituto di Neurobiologia e Medicina Molecolare (INMM) dove dirige un gruppo di ricerca impegnato nello studio del controllo dell’espressione genica in cellule normali e trasformate.
Tel.: 06.49934225
E-mail: donato.civitareale@inmm.cnr.it

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